前沿 | PROTAC連接基團(tuán)（Linker）的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

來(lái)源：藥智網(wǎng)|青梅

1. 簡(jiǎn)介

自 2001年第一次概念驗(yàn)證以來(lái)，小分子誘導(dǎo)的靶向蛋白質(zhì)降解逐漸成為藥物研發(fā)的一個(gè)熱門方向。用于誘導(dǎo)降解的策略主要有兩種，一是使用可以改變E3連接酶底物識(shí)別域的小分子，即所謂的分子膠，從而允許募集新底物進(jìn)行蛋白水解； 二是使用嵌合小分子，該小分子由與結(jié)合所需靶蛋白的模塊連接的E3連接酶結(jié)合部分組成。本文將主要討論后者。

靶向嵌合體（PROTAC，也稱為 SNIPER、uSMITE 或降解劑）和雙功能小分子降解劑由于其催化活性（效力）、通過(guò)蛋白間相互作用誘導(dǎo)同工酶選擇性的能力以及偏離“五規(guī)則”而廣為人知。PROTAC能夠同時(shí)結(jié)合E3連接酶的底物識(shí)別域和感興趣的蛋白質(zhì)(POI)，從而誘導(dǎo)非同源泛素化和隨后的POI降解。目前有六種獨(dú)特的嵌合降解劑分子在人體中的效用正在通過(guò)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究。PROTACs的獨(dú)特代謝活性來(lái)自于它們能夠從泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS) 中適當(dāng)?shù)厥褂肦ING泛素連接酶，該系統(tǒng)通過(guò)用多聚泛素鏈標(biāo)記蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，從而標(biāo)記它們進(jìn)行蛋白水解。

PROTAC的效力和同工酶選擇性可以通過(guò)連接基團(tuán)（Linker）內(nèi)的構(gòu)-效關(guān)系 (SAR) 進(jìn)行優(yōu)化。連接部分的長(zhǎng)度和化學(xué)成分已被證明會(huì)影響 PROTAC的結(jié)構(gòu)剛性、疏水性和溶解性等。目前，關(guān)于連接部分的長(zhǎng)度部分的SAR研究主要還是經(jīng)驗(yàn)性的，是一項(xiàng)時(shí)間和勞動(dòng)密集型的工作。雖然通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算研究在合理的PROTAC設(shè)計(jì)方面取得了很大進(jìn)展，但連接基團(tuán)的設(shè)計(jì)、合成依然是一項(xiàng)繁重的工作。Michael D. Burkart等最近發(fā)表在Journal of Medicinal Chemistry的觀點(diǎn)文章，闡述了接頭設(shè)計(jì)在靶向嵌合體的蛋白水解中的作用。

2. PROTAC中連接基團(tuán)的優(yōu)化

2.1 提高合成通量的方法

當(dāng)前簡(jiǎn)化接頭變體SAR研究的方法包括：通過(guò)使用正交保護(hù)的雙功能接頭固相合成、銅催化點(diǎn)擊化學(xué)、活化酯、和Staudinger連接化學(xué)來(lái)提高合成通量（圖1）。有許多策略已被證明可以實(shí)現(xiàn)基于免疫調(diào)節(jié)酰亞胺藥物（CRBN 招募）系統(tǒng)的 PROTAC接頭變體套件的模塊化合成，但到目前為止它們似乎都沒(méi)有在該領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。盡管所提出的大多數(shù)策略都可以轉(zhuǎn)化為VHL（Von Hippel?Lindau）或其他E3連接酶招募系統(tǒng)，但只有銅催化的點(diǎn)擊平臺(tái)特別證明了這一點(diǎn)，然而將三唑部分引入接頭可能不會(huì)產(chǎn)生理想的物理化學(xué)由于其高拓?fù)淇倶O性表面積。所有這些策略都將從功能化（炔烴、Boc 保護(hù)的胺末端或疊氮化物末端）連接的E3連接酶配體庫(kù)的可用性中受益匪淺。實(shí)際上，許多合成模塊可以購(gòu)買到。

圖1. 已發(fā)表的用于合成PROTAC的合成方法。

2.2 合理的PROTAC連接基團(tuán)的設(shè)計(jì)

2.2.1 利用X-ray晶體學(xué)數(shù)據(jù)和計(jì)算模型合理設(shè)計(jì)PROTAC

Gadd等人解決了三元復(fù)合物中降解劑（MZ1）的第一個(gè) X 射線結(jié)構(gòu)，使用這些數(shù)據(jù)，他們能夠合理地設(shè)計(jì)出更具選擇性的溴結(jié)構(gòu)域降解劑（AT1）。Farnaby及其同事能夠從SMARCA2:PROTAC 1:VHL (PDB 6HAY)的共晶結(jié)構(gòu)中識(shí)別 PROTAC 1的PEG接頭和VHL之間關(guān)鍵的穩(wěn)定相互作用?；谶@些數(shù)據(jù)，他們?cè)诓粻奚a(chǎn)生ACBI1的關(guān)鍵PEG相互作用的情況下，通過(guò)在接頭區(qū)域插入苯基部分引入了額外的T形堆積相互作用并增加了剛性（圖2a）；一種改進(jìn)的SMARCA2/4降解劑。

Nowak等通過(guò)使用一組X射線結(jié)構(gòu)進(jìn)行RosettaDock模擬，基于已知的泛溴域降解劑dBET6（圖2b）開(kāi)發(fā)了一種新型BRD4選擇性降解劑ZXH-3-26相關(guān)的、PROTAC結(jié)合的三元復(fù)合物。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)還表明，PROTAC接頭長(zhǎng)度的最小化將通過(guò)減少POI-PROTAC-連接酶三元復(fù)合物的有利結(jié)合模式的數(shù)量來(lái)提高降解劑的選擇性。

Testa等使用 BRD4BD2和VHL與已知溴結(jié)構(gòu)域降解劑 MZ1 (PDB 5T35) 結(jié)合的復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬，確定了一種有效的異構(gòu)體選擇性（BRD4BD2選擇性）溴結(jié)構(gòu)域降解劑（圖2c）。

圖2. 合理設(shè)計(jì)PROTAC

2.2.2 PROTAC設(shè)計(jì)軟件開(kāi)發(fā)

為了使用分子操作環(huán)境 (MOE) 和開(kāi)源Rosetta軟件套件合理設(shè)計(jì)從頭 PROTAC開(kāi)發(fā)，更嚴(yán)格的計(jì)算方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)了（圖3）。這些方法不僅成功地在計(jì)算機(jī)上重現(xiàn)了從X射線晶體學(xué)中確定的PROTAC結(jié)合模式，而且還與基于先前生物學(xué)評(píng)估的效力和選擇性趨勢(shì)一致。

Drummond等使用MOE軟件套件開(kāi)發(fā)了一系列用于生成和分析PROTAC三元復(fù)合物的協(xié)議（圖3a）。在這些協(xié)議中，最有效的方法是在沒(méi)有POI和連接酶的情況下對(duì)降解劑的構(gòu)象空間進(jìn)行采樣，以識(shí)別在后續(xù)步驟中將進(jìn)行對(duì)接模擬的降解劑構(gòu)象。

Zaidman等人使用開(kāi)源Rosetta軟件套件來(lái)開(kāi)發(fā)PROsettaC（圖3b）。就此而言，PROsettaC與Drummond等開(kāi)發(fā)的相似，因?yàn)閮蓚€(gè)配體與其各自目標(biāo)的二元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是必要的輸入。

Bai等人描述了另一種基于Rosetta的協(xié)議（圖3c）。該協(xié)議仍然依賴配體結(jié)合的二元 X 射線晶體結(jié)構(gòu)作為初始輸入，但是它使用了最初為抗體-抗原對(duì)接開(kāi)發(fā)的全局對(duì)接協(xié)議來(lái)生成不同姿勢(shì)的POI 和關(guān)于固定的配體位置的連接酶的初始集合。

總體而言，這些研究表明PROTAC開(kāi)發(fā)受益于計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化。計(jì)算機(jī)中PROTAC開(kāi)發(fā)的目標(biāo)旨在通過(guò)最大限度地減少合成和生物評(píng)估分子的數(shù)量來(lái)提高通量，以便令人滿意地降解目標(biāo)蛋白質(zhì)。

圖3. PROTAC計(jì)算方法開(kāi)發(fā)的最新進(jìn)展

2.3 連接基團(tuán)的經(jīng)驗(yàn)SAR

通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的連接基團(tuán)長(zhǎng)度與降解效率之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作為測(cè)試 E3連接酶和POI之間兼容性的一種手段，可能最好以較長(zhǎng)的接頭長(zhǎng)度開(kāi)始經(jīng)驗(yàn)性接頭長(zhǎng)度 SAR 研究。然而，數(shù)據(jù)并不一定表明任何大于最佳長(zhǎng)度的接頭都會(huì)產(chǎn)生成功的降解劑；只是一般來(lái)說(shuō)，由于沒(méi)有空間沖突，較長(zhǎng)的連接子會(huì)增加找到降解劑的機(jī)會(huì)。

3. 總結(jié)

PROTAC開(kāi)發(fā)活動(dòng)的經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)正在被嵌合小分子合成方法、三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征、計(jì)算協(xié)議的進(jìn)步以及對(duì)先前研究的系統(tǒng)分析的均衡發(fā)展所逐漸替代。PROTAC開(kāi)發(fā)為藥物設(shè)計(jì)提供了一個(gè)戲劇性的彎路，因?yàn)橹攸c(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到能夠穩(wěn)定非同源蛋白質(zhì)相互作用足夠長(zhǎng)的小分子以進(jìn)行多泛素化。這種事件驅(qū)動(dòng)的藥理學(xué)使得重新利用因缺乏效力或缺乏選擇性而被擱置的先前廢棄的配體成為可能。它還提供了一種有效靶向非催化蛋白質(zhì)靶標(biāo)的方法，顯著擴(kuò)展了潛在的先導(dǎo)化合物。通過(guò)本文所描述的專業(yè)領(lǐng)域之間的持續(xù)合作，期望能夠通過(guò)開(kāi)發(fā)處能夠替代連接基團(tuán)經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)的方案來(lái)減少PROTAC的開(kāi)發(fā)時(shí)間。

參考文獻(xiàn)：

Troy A. Bemis, James J. La Clair, and Michael D. Burkart* Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J. Med. Chem. 2021.

責(zé)任編輯：琉璃

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