經過20年T細胞工程的精細調整，嵌合抗原受體（CAR）T細胞在白血病和淋巴瘤患者中的巨大臨床成功導致了該領域研究的指數級增長。2017年，美國FDA首次批準了CAR-T細胞療法，將該領域推入了一個快節奏的創新研究時代。

自該里程碑事件以來這一領域有了哪些進展？這些進展又將如何影響CAR-T細胞治療的未來？近期，來自麻省總醫院和哈佛醫學院的研究人員在Nature Reviews Cancer上發表了一篇綜述，簡要回顧了CAR的基本設計，介紹了CAR-T細胞療法的毒性和耐藥機制以及克服這些挑戰的新穎工程和藥物干預措施。作者還討論了有望在將來1–2年內進入臨床的CAR-T細胞療法新靶點和適應癥，以及可能對CAR-T細胞治療的未來產生重大影響的制造創新。

來源：Nature Reviews Cancer [1]

CAR的改進

1993 年，第一代基于 CD3ζ鏈的CAR-T細胞被開發出來，其組織結構包含：編碼單鏈可變片段（scFv）的第一代 CAR 的嵌合基因序列、可識別腫瘤相關抗原的抗原結合區、鉸鏈、跨膜結構域（TM）和信號域，如 CD3ζ。

第一代CAR包含細胞內信號域，但沒有共刺激分子。這類 CAR-T 細胞在體內的持續擴增有限，不具備大規模殺滅腫瘤細胞的能力，在臨床試驗中的效果并不理想。

T細胞的完全激活一方面依賴于胞外抗原結合域與抗原的結合所傳遞的第一信號，另一方面也需要共刺激分子受體與其配體結合所傳遞的第二信號，而腫瘤細胞表面通常不表達這類共刺激配體。在第一代的基礎上，第二代CAR引入一個共刺激結構域CD28或4-1BB，在臨床試驗中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題，并提高了其作用持久性。

圖1 |基本的第二代CAR-T細胞結構示意圖。（來源：Nature Reviews Cancer[1]）

用第二代CD19靶向CAR-T細胞治療的首批B細胞白血病患者具有深遠而持久的療效。因此，CAR-T細胞療法徹底改變了血液系統惡性腫瘤的治療方法，并因其對CD19+腫瘤的療效，于2017年獲得FDA批準（主要的已發表臨床試驗結果見表1）。

表1 | 主要的已發表CAR-T細胞療法試驗

B-ALL = B細胞急性淋巴細胞白血病；BCMA = B細胞成熟抗原；CAR = 嵌合抗原受體；CRS = 細胞因子釋放綜合征；DLBCL = 彌漫性大B細胞淋巴瘤；MSKCC= 紀念斯隆-凱特琳癌癥中心；NCI = 國家癌癥研究所；UPenn = 賓夕法尼亞大學；aFDA批準。（來源：Nature Reviews Cancer [1]）

目前所有FDA批準的CAR-T細胞產品都是基于第二代設計，具有CD28或4-1BB共刺激域。除CD28和4-1BB外，其他常見的共刺激結構域還包括OX40、CD27和T-細胞可誘導共刺激分子（ICOS）。如果在一個構造中使用兩個共刺激域，則認為這是第三代CAR。

圖2 | 共刺激結構域被加入新一代CAR-T細胞，以提高其在輸注后產生更多T細胞，并在循環中存活更長時間的能力。（來源: Nature Reviews Clinical Oncology[3]）

一些研究者將具有增強T細胞功能的CAR稱為“第四代”CAR，特別是當它們產生額外的蛋白質分子（如細胞因子，IL-12）或擁有額外的受體（如共刺激配體，4-1BBL、CD40L）時。這些CAR也被稱為TRUCK（T cells redirected for universal cytokine killing）或“裝甲”CAR。

CAR的毒性和耐藥機制及相應解決方法

正在顯露的毒性機制及解決方案

與CAR-T細胞治療相關的兩個標志性臨床毒性是細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性，在臨床轉化前兩者均未通過動物模型預測到。CRS通常在CAR-T細胞治療的第一周內表現為發熱、低血壓和呼吸功能不全，血清細胞因子水平較高（圖3）。神經毒性表現為暫時性工作記憶喪失、譫妄、癲癇發作和罕見的急性腦水腫。

CRS和神經毒性都歸因于分泌細胞因子的T細胞的快速激活和擴增。目前的理解是，由CAR-T細胞和/或配體-受體相互作用分泌的細胞因子激活myeloid compartment的額外免疫細胞，進而釋放更多的細胞因子，形成一個激活炎癥的循環，即細胞因子風暴。病人體內自然產生的腎上腺素也被證明有助于這種自我放大的循環。

圖3 | CAR-T細胞誘導的CRS和神經毒性的分子水平認識和治療干預現狀。（來源：Nature Reviews Cancer [1]）

雖然神經毒性在臨床上與CRS有關，但其機制似乎有所不同。患者的嚴重神經毒性與腦脊液中高水平的促炎細胞因子（IL-6、IL-8、CCL2和CXCL10）相關。血液-腦脊液屏障破壞的證據與神經毒性等級相關，但腦脊液中的白細胞或CAR-T細胞計數不相關。盡管有這些觀察，神經毒性的機制目前尚不清楚。然而，作者推測促炎細胞因子的增加可能激活腦血管系統中的內皮細胞，從而導致區域通透性增加和毛細血管滲漏（稱為血管源性水腫），表現為局灶性水腫和神經毒性。最近一項研究提出的另一個可能的解釋是，腦壁細胞表達CD19，CAR-T細胞對這些細胞的活性導致了神經毒性。

臨床上，克服CRS的主要治療方法是用IL-6受體單抗托珠單抗來阻斷細胞因子的反饋回路。皮質類固醇也經常與托珠單抗聯合使用，以減少炎癥和腦血管源性水腫。然而，這兩種干預措施似乎都不能阻止患者體內CAR -T細胞的擴增。

除了IL-6受體阻斷劑外，其他的干預措施也在研究中。例如，通過單克隆抗體（lenzilumab）中和或通過基因改變CAR-T細胞以敲除GM-CSF，可以限制CRS和神經炎癥；用甲酪氨酸阻斷兒茶酚胺可以保護小鼠免受CRS致命并發癥的影響；其他研究小組試圖控制CAR-T細胞毒性，不是通過解決毒性本身，而是通過使用達沙替尼（一種FDA批準的酪氨酸激酶抑制劑）來控制CAR-T細胞的負荷和效力。

在某些情況下，神經毒性或CRS相關的多器官衰竭可能是致命的。較高的腫瘤負荷和CAR-T細胞擴增與較高的CRS等級相關。總的來說，具有4-1BB共刺激結構域的CAR似乎比那些具有CD28結構域的CAR產生更少的神經毒性和CRS。

耐藥機制及解決方案

與CAR-T細胞治療后復發相關的常見機制之一是抗原丟失（圖4上）。選擇壓力使CD19突變是最常見的抗原丟失機制。此外，有報道揭示通過一個叫做trogocytosis的過程，CAR從腫瘤細胞中去除目標抗原并將其內化，導致腫瘤細胞上的抗原密度降低。這會影響基于CD28和基于4-1BB的CAR-T細胞，但會產生不同的后果，因為基于CD28的CAR對抗原密度降低相對沒那么敏感。

防止抗原逃逸最直接的方法是開發針對其他抗原的CAR，這些CAR可以串聯使用。靶向CD20和CD22的CAR-T細胞在臨床上以獨立和串聯scFv的兩種形式開發。另一種方法是增加靶細胞的抗原表達。小分子γ-分泌酶抑制劑可通過破壞B細胞成熟抗原（BCMA）的裂解來增加骨髓瘤細胞上BCMA的表達。這種靶向BCMA的CAR-T細胞聯合治療目前正在進行臨床試驗（NCT03502577 ）。

圖4 | 抗原依賴性和抗原非依賴性（如T細胞衰竭）耐藥。（來源：Nature Reviews Cancer [1]）

抗原丟失可以解釋一些復發，但并非所有復發的患者都有抗原陰性問題，這表明可能還有其他因素導致耐藥，如CAR-T細胞衰竭。腫瘤細胞中Fas 相關死亡功能域蛋白（FADD）、BH3相互作用域死亡激動劑（BID）和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體2（TRAIL2）的缺失使其對CD19靶向CAR-T細胞的療效更具耐藥性，這是因為CAR的細胞毒性和增殖能力較低。此外，缺乏這些死亡受體分子的ALL細胞對CAR的長時間刺激導致T細胞衰竭。

隨著免疫檢查點阻斷技術的發展，腫瘤免疫治療領域發生了革命性的變化。免疫檢查點阻斷在克服T細胞衰竭中的作用已被應用于CAR-T細胞，包括組合治療、CAR-T細胞抗免疫檢查點分子的自分泌和CAR-T細胞自身免疫檢查點基因的遺傳干擾。目前有許多正在進行的臨床試驗（NCT02650999、NCT02706405、NCT02926833和NCT03310619）評估了CD19靶向CAR-T細胞聯合免疫檢查點阻斷（靶向PD-1或PD-L1）的效果。早期結果表明，聯合治療是安全的，并且毒性低。

目前，CAR-T細胞治療領域的大多數經驗都是關于血液系統惡性腫瘤的治療，因此腫瘤微環境（TME）在治療中的作用要小得多。然而，當該領域進展到針對實體瘤的研究時，抑制性TME也可能產生對CAR-T細胞治療的耐藥性。對于難以穿透、高度免疫抑制的實體惡性腫瘤，如膠質母細胞瘤或胰腺癌，尤其值得關注。缺乏吸引CAR-T細胞的趨化因子、異常的血管系統和產生細胞外基質的癌癥相關成纖維細胞，都會使CAR-T細胞甚至難以進入腫瘤。

在TME中增強CAR-T細胞的運輸以及限制抗炎細胞因子和細胞抑制作用的創新方法也在開發中。一種策略是通過分泌促炎性可溶性因子來增加CAR-T細胞的應答。IL-7和CCL19在CAR-T細胞中的過表達是淋巴器官中形成T細胞區所必需的，這增加了促炎性樹突狀細胞和T細胞向實體腫瘤組織的浸潤，并增強了小鼠模型中腫瘤的消退。另一個策略是重定向或繞過抑制性TME。例如在前列腺癌中，在前列腺特異性膜抗原靶向CAR載體中表達一個dominant-negative TGFβ受體，以減少TGF-β抑制T細胞的活性的作用。這種特殊的CAR結構現在正在進行I期臨床試驗（NCT03089203）。

有希望的新靶點和適應癥

多發性骨髓瘤

多發性骨髓瘤CAR-T細胞治療的主要靶點是BCMA（NCT02658929 、NCT02546167）。然而，正如CD19靶向CAR-T細胞治療后出現CD19陰性復發，BCMA陰性復發也可能發生。兩個研究小組提出了一個替代選擇，即靶向BCMA和另一種在多發性骨髓瘤細胞上表達的分子——跨膜激活劑及鈣調親環素配體相互作用分子（TACI）的基于配體的CAR-T細胞。

G蛋白偶聯受體， GPRC5D是多發性骨髓瘤的另一個靶點，其在CD138+多發性骨髓瘤細胞上的表達模式獨立于BCMA的表達。一些其他靶點也在開發中，包括CD38、CD138和SLAM家族成員7（SLAMF7）。

實體瘤：泛癌

CAR-T細胞治療領域的一個主要關注點是其在血液惡性腫瘤之外的適用性。許多因素阻礙了制造有效治療實體瘤的CAR-T細胞，其中包括缺乏腫瘤特異性抗原和免疫抑制TME。該領域的許多領導者認為，除了CD19之外，只有不到12個可行的CAR-T細胞靶點，而確定在腫瘤中具有高、均勻表達但在健康組織中沒有表達的靶點已被證明是困難的。

B7-H3（也稱為CD276）免疫檢查點分子在過去幾年中一直是一種流行的免疫治療靶點，一些有希望的臨床試驗（ NCT02982941、NCT02381314、NCT03406949、NCT02628535和 NCT03729596）用單克隆抗體靶向該分子。研究表明，在抗原密度高的情況下，B7-H3靶向CAR-T細胞在體外和體內都是有效的，這在髓母細胞瘤、骨肉瘤和尤文肉瘤等兒科癌癥中也是如此。然而，當抗原濃度較低時，B7-H3靶向CAR-T細胞活性較低，提示B7-H3靶向CAR-T細胞治療可能具有一個有效、無毒的臨床治療窗口。

以間皮素為靶點的CAR-T細胞近年來被廣泛應用于胰腺癌、肺癌和卵巢癌等多種疾病。臨床前模型是有希望的，一些臨床試驗正在進行中。初步結果表明，間皮素靶向CAR-T細胞是安全的，并且具有抗腫瘤活性，這對CAR-T細胞在實體瘤治療中的前景是有希望的。更多的臨床研究正在評估間皮素靶向的CAR-T細胞治療是否可以通過聯合免疫檢查點阻斷來增強T細胞應答。最近，使用基于間皮素靶向T細胞受體融合結構（TRuC）的CAR公布了早期I期結果（NCT03907852）。與傳統的CAR-T細胞相比，這些CAR保留了它們的細胞毒性，但具有細胞因子釋放更低和療效更高的特點。

實體瘤：腦癌

腦瘤對免疫療法浪潮的反應仍然較小。然而，由于大腦獨特的生理構造，CAR-T細胞療法治療腦瘤是有潛力的。與大分子因血腦屏障而難以進入大腦腫瘤不同，T細胞和T細胞療法可在靜脈輸注后滲入大腦。

CAR-T細胞治療膠質母細胞瘤的初步臨床試驗以EGFRvIII、IL-13Rα2和HER2（也稱為ERBB2）為靶點，但由于靶抗原丟失，治療效果不佳。為了克服膠質母細胞瘤中經常發現的靶抗原表達的異質性，一種基于chlorotoxin（CLTX）肽的CAR-T細胞被設計出來，即使在沒有其他膠質母細胞瘤相關抗原的情況下也具有強大的抗腫瘤活性。靶向CLTX肽的CAR-T細胞治療可能是有希望的，因為它可能沒有先前靶點中發現的抗原異質性問題。

針對神經母細胞瘤的雙唾液酸神經節苷脂GD2靶向CAR-T細胞在臨床試驗中已獲得良好的耐受性。研究指出，GD2靶向CAR-T細胞可能對組蛋白H3 K27M（H3-K27M）突變的彌漫性中線膠質瘤（一種普遍致命的兒科癌癥）有效。

此外，細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖GPC2也被選為神經母細胞瘤的新靶點。GPC2在神經母細胞瘤組織中高表達，但在正常的兒童組織中不表達，可能也是一種有效的CAR-T細胞靶點。

CAR制造的創新

基因轉移

基因重組T細胞療法的一個局限性是臨床上使用昂貴且生產時間長的病毒載體。此外，病毒載體對可編碼的DNA長度有大小限制（AAV約4kb，腺病毒約8.5kb，慢病毒載體約10kb）。在過去的10年中，轉座子作為一種非病毒的方法被開發用來生產CAR-T細胞，這種基因轉移的方法比基于病毒的方法更經濟。生物技術公司Poseida Therapeutics目前正在使用基于piggyBac的CAR-T細胞進行兩項臨床試驗 [4,5]。

此外，基于CRISPR–Cas9的電穿孔技術被用于將DNA序列（>1kb）轉移到原代人T細胞基因組中的特定位置。然而，值得注意的是，目前這項技術仍然局限于大的基因載荷。除了遺傳物質遞送方式的改變外，CAR-T細胞制造的改進還涉及T細胞的體外培養。多個研究小組致力于確定適合最佳生長條件的細胞因子混合物。

改善效應細胞類型

目前的生產工藝通常使用來自患者的異質性T細胞（某些情況下CD4+T細胞和CD8+T細胞分離除外）。然而，有證據表明某些T細胞亞群可能比其他亞群更有效。

臨床試驗已使用中央記憶T細胞制造基于CD28的CD19靶向CAR-T細胞（NCT01318317和NCT01815749）。初步結果表明，這些細胞是有效的，但與批量生產的CD19靶向CAR-T細胞相比，不一定有更長的持久性。其他潛在的有利亞群包括γδT細胞。CD26highCAR-T細胞也被研究，因其在實體瘤模型中具有優越的功能。

目前有幾種方法可以使CAR-T細胞產品更像一種“通用”的藥物（圖5）。其一是分體式、通用和可編程（SUPRA）CAR，其帶有一個zip系統來調節T細胞的反應。該方法仍是自體細胞產品，但一個CAR可感知多種抗原并做出響應。還有一種組合方法，使用了兩種不同的zip系統，一種具有CD3ζ信號域，另一種具有共刺激域。其他潛在的通用CAR包括基于生物素結合免疫受體的二聚系統和帶有新表位標記的switch模塊。

圖5 | 功效增強的CAR-T細胞亞群和具有可切換靶點的通用CAR。（來源：Nature Reviews Cancer [1]）

同種異體CAR

“現貨型”同種異體CAR-T細胞療法備受追捧，主要是為了改善產品標準化、患者等待時間、物流成本等。但使用同種異體T細胞療法有兩個主要障礙，即引起GvHD和排斥反應。

自然殺傷（NK）細胞由于其固有的抗腫瘤活性，一直被作為同種異體基因產品開發的基礎。一種新的方法是從臍血中提取NK細胞，并用抗CD19 CAR載體進行轉導。為了提高NK細胞的持久性，研究人員還將加入了IL-15的轉基因。

CAR巨噬細胞（CAR-M）也能交叉遞呈抗原并激活T細胞。用CAR-M治療小鼠肺轉移和腹腔內癌異種移植模型有效降低了腫瘤負荷。在人源化小鼠中，CAR-M能增強T細胞抗腫瘤應答，單細胞RNA測序顯示出促炎性腫瘤微環境的誘導。

CAR還被用來重定向免疫抑制的CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞），作為自身免疫疾病和器官移植的潛在療法。CAR-Treg細胞的首次臨床試驗于2019年獲得許可，用于預防終末期腎病患者 HLa-a2不匹配腎移植后的排斥反應。此外，一些研究小組已經證明，在體內使用CAR-Treg細胞可以預防同種異體皮膚移植排斥反應。CAR-Treg細胞還被用來改善結腸炎。然而，由于難以從傳統T細胞中純化這一細胞亞群，CAR-Treg細胞的制造仍然是未來臨床應用的一個關注點，目前新的純化方法正在探索中。

圖6 | 超越傳統的CAR-T細胞：CAR自然殺傷細胞、CAR巨噬細胞和CAR-Treg細胞（來源：Nature Reviews Cancer [1]）

小結

從2017年首個CAR-T細胞療法獲FDA批準以來，針對不同靶點、不同適應證的大量臨床試驗陸續開展，這些試驗結果揭示了新的療效、毒性和耐藥性機制，并催化了新靶點的尋找、信號機制的闡明和新技術的應用。而在CAR設計、轉導方法和最佳細胞類型的選擇方面的創新，必將會改善和改變許多不同類型癌癥的治療效果。

參考資料：

[1] Rebecca C. Larson & Marcela V. Maus. Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature Reviews Cancer (2021)

[2] CAR T Cells: Engineering Patients’ Immune Cells to Treat Their Cancers (來源：NATIONAL CANCER INSTITUTE官網)

[3] Brentjens R, et al. Driving CAR T cells forward. Nature Reviews Clinical Oncology (2016)

[4] Barnett,B.E. et al. piggyBacTM-produced CAR-T cells exhibit stem-cell memory phenotype. Blood (2016).

[5] Poseida Therapeutics. Pipeline. https://poseida.com/pipeline/(2020).