2021年7月，美國(guó)基因療法公司Adverum Biotechnologies Inc.（NASDAQ:ADVM，Adverum）暫停了其AAV基因治療藥物ADVM-022用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變黃斑水腫（DME）的II期臨床試驗(yàn)，原因是一例受試者在接受單次高劑量治療30周后，出現(xiàn)了眼壓過(guò)低、炎癥以及失明等嚴(yán)重不良反應(yīng)，引發(fā)了業(yè)界對(duì)該藥物安全性的擔(dān)憂。

ADVM-022是一種使用Adverum專有載體衣殼AAV2.7m8的基因療法。該療法通過(guò)眼部單次玻璃體內(nèi) (IVT) 注射進(jìn)行，旨在使視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生長(zhǎng)久的治療和預(yù)防的效力，減輕頻繁注射抗VEGF抗體藥物的負(fù)擔(dān)，最終改善患者視力。

盡管面對(duì)臨床安全挑戰(zhàn)，基因療法仍然具有不可比擬的治療優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)于缺少替代療法的單基因遺傳疾病來(lái)說(shuō)。因?yàn)樵摨煼軓母旧涎a(bǔ)充或修復(fù)缺陷基因，恢復(fù)健康基因的正常生物學(xué)功能，在患者中最大限度地減少甚至消除影響一生的癥狀。

近五年，眼部基因療法臨床試驗(yàn)也在迅速增加，針對(duì)多種罕見遺傳性視網(wǎng)膜疾病和基因突變角膜疾病，比如無(wú)脈絡(luò)膜血癥、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、Stargardt 病、X連鎖視網(wǎng)膜劈裂和X連鎖視網(wǎng)膜色素變性等。更值得期待的是，基因治療為遭受如AMD（老年性黃斑病變）等常見眼部疾病的病人（數(shù)億人）帶來(lái)希望。因?yàn)槌Ｒ?guī)的VEGF抗體注射療法需要長(zhǎng)期頻繁和定期的玻璃體內(nèi)注射，嚴(yán)重降低了患者依從性，也增加了治療風(fēng)險(xiǎn)。而基因療法正在成為其行之有效的治療方案。

正在進(jìn)行的遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因治療臨床試驗(yàn)（部分），圖源：Paul Yang，AAO 2020

重組AAV基因載體（rAAV）治療眼部疾病的優(yōu)勢(shì)

在基因治療中，病毒載體技術(shù)是目前主要的基因?qū)敕绞剑摷夹g(shù)的進(jìn)步很大程度上驅(qū)動(dòng)著基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。近二十年來(lái)，腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體掀起了該領(lǐng)域的臨床熱潮。

AAV是一種小型無(wú)包膜細(xì)小病毒，作為遞送系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢(shì)，比如無(wú)致病性、高效持續(xù)表達(dá)、易于操作以及免疫原性低等。AAV載體攜帶的治療基因（gene of interest，GOI）進(jìn)入細(xì)胞后，將轉(zhuǎn)錄翻譯為功能蛋白，達(dá)到治療一系列疾病的目的。

使用AAV進(jìn)行基因治療的一系列疾病。圖源：參考文獻(xiàn)1

rAAV是眼部基因治療的主要載體，在治療性基因遞送中，AAV單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）基因組中編碼調(diào)節(jié)蛋白(Rep)和結(jié)構(gòu)蛋白 (cap)脫氧核糖核酸（DNA）序列被所需的GOI表達(dá)盒所替換，稱為重組AAV (rAAV)。AAV外衣殼（capsid）可以幫助GOI靶向特定組織，迄今已在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中鑒定出12種不同的AAV血清型，它們的衣殼成分不同，顯示出不同的細(xì)胞趨向性、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和免疫原性。血清型AAV1、2、4、5、6、7、8 和 9 都顯示出視網(wǎng)膜組織的趨向性。

AAV治療載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖源：catapult.org.uk

在治療眼疾方面，基因療法有顯著優(yōu)勢(shì)，這是由眼疾的遺傳基礎(chǔ)和眼部隔室的獨(dú)特性所決定的。

由于眼睛的解剖結(jié)構(gòu)明確，物理空間封閉有限，這為局部給藥提供了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。血眼屏障有助于眼部免疫特權(quán)，針對(duì)基因治療產(chǎn)品的免疫反應(yīng)有限。而且，眼睛的視網(wǎng)膜細(xì)胞不再進(jìn)行分裂，可允許持續(xù)的基因表達(dá)且不會(huì)整合入基因組。最主要的是一系列眼部疾病（包括遺傳性失明）的潛在遺傳因素已被鑒定出來(lái)。此外，近來(lái)相關(guān)動(dòng)物模型的開發(fā)也讓眼科研究取得重大進(jìn)展，有利于開展眼部基因治療試驗(yàn)。

AAV2病毒載體將治療基因通過(guò)視網(wǎng)膜下導(dǎo)入眼部。圖源：https://luxturnahcp.com/

Spark Therapeutics公司的Luxturna?（voretigene neparvovec-rzyl）是首個(gè)獲批上市的用于治療眼部罕見病的基因治療產(chǎn)品，Luxturna能將RPE65基因的正?？截愞D(zhuǎn)導(dǎo)入視網(wǎng)膜色素細(xì)胞 （RPE），治療雙等位基因RPE65突變的Leber 先天性黑蒙（LCA2）。

Luxturna的獲批是眼部疾病基因療法發(fā)展的重要里程碑。該項(xiàng)目的成功驗(yàn)證了基因療法概念的可行性，也證實(shí)其在恢復(fù)或保持視力方面的重要價(jià)值。

rAAV眼部基因治療的技術(shù)瓶頸和相應(yīng)解決方案

rAAV產(chǎn)品已顯示出作為基因治療藥物的廣闊應(yīng)用前景，目前全球已有超過(guò)200項(xiàng)基于rAAV的臨床試驗(yàn)。然而，多項(xiàng)在研項(xiàng)目并不像在LCA2 患者中觀察到的那樣始終如一地轉(zhuǎn)化為臨床結(jié)果。

事實(shí)上，作為一種由病毒基因組和多種結(jié)構(gòu)蛋白組成的復(fù)雜生物制劑，rAAV產(chǎn)品的上游開發(fā)以及下游生產(chǎn)過(guò)程都面臨著許多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何保證rAAV的活性功效并降低臨床使用劑量，是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，在優(yōu)化生產(chǎn)純化的同時(shí)，設(shè)計(jì)改造AAV載體以提高rAAV產(chǎn)品與靶細(xì)胞的親和力，增強(qiáng)GOI效力也非常重要。

AAV 產(chǎn)品的上游生產(chǎn)過(guò)程

AAV產(chǎn)品的下游生產(chǎn)過(guò)程。圖源：biovian.com

1、優(yōu)化衣殼設(shè)計(jì)，改進(jìn)載體工具

當(dāng)所用載體的靶向和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有限，就不得不增加使用劑量以達(dá)到預(yù)期的臨床效果，但高劑量的病毒樣產(chǎn)品也代表混有更多的雜質(zhì)，增加誘發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，高劑量藥物難以均衡轉(zhuǎn)導(dǎo)，不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平也難以控制。

為了提高載體靶向性和特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，一方面，工程化改造AAV衣殼是優(yōu)化遞送載體的關(guān)鍵領(lǐng)域。AAV產(chǎn)品的衣殼質(zhì)量和視網(wǎng)膜細(xì)胞趨向性是實(shí)現(xiàn)安全有效的眼部基因治療的重要特征。人們可以從天然分離株中提取AAV衣殼，也可通過(guò)合理設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化或計(jì)算機(jī)引導(dǎo)技術(shù)對(duì)衣殼進(jìn)行改造。在UC Berkeley就職的教授David Schaffer是使用“直接進(jìn)化”的先行者，其實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生了現(xiàn)在應(yīng)用于Adverum公司ADVM-022的視網(wǎng)膜特性性的AAV2.7m8新型載體。同時(shí)他也是4DMT公司的科學(xué)創(chuàng)始人，4DMT現(xiàn)在使用直接進(jìn)化的手段發(fā)現(xiàn)新型的AAV載體，并在多種疾病領(lǐng)域進(jìn)行了基因治療的布局和開發(fā)，包括，眼科，心血管疾病，及呼吸系統(tǒng)疾病。

值得關(guān)注的是，AAV衣殼工程化技術(shù)也是華人科學(xué)家劉勝江和陳海峰聯(lián)合創(chuàng)立的Avirmax公司的研發(fā)重點(diǎn)。據(jù)官網(wǎng)介紹，Avirmax擁有獨(dú)特的AAV衣殼工程技術(shù)，其開發(fā)的rAAV與受體的結(jié)合更強(qiáng)，能夠穿透玻璃體內(nèi)限制膜（Inner limiting membrane, ILM），將GOI高效導(dǎo)入視網(wǎng)膜細(xì)胞，產(chǎn)生高于野生型AAV衣殼成百上千倍的濃度。Avirmax的rAVV產(chǎn)品可用于常見視網(wǎng)膜疾病，比如wAMD、DME、PCV以及十余種罕見視網(wǎng)膜疾病的治療。下圖是Avirmax的一種改造過(guò)的AAV衣殼的計(jì)算機(jī)模擬圖。

經(jīng)工程改造的AAV-VP1衣殼蛋白

為了增加rAAV功效，人們還可以借助于基因工程和優(yōu)化等技術(shù)，增強(qiáng)AAV載體GOI的表達(dá)水平，以達(dá)到降低藥物使用量的目的。Avirmax公司正在使用這類轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)表達(dá)技術(shù)，他們的數(shù)據(jù)顯示，該技術(shù)能夠顯著增強(qiáng)AAV治療載體中的GOI的表達(dá)（提高10倍）。

2、降低免疫原性，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)

AAV基因治療產(chǎn)品面臨的另一項(xiàng)挑戰(zhàn)是如何實(shí)現(xiàn)無(wú)雜質(zhì)載體生產(chǎn)的可擴(kuò)展性和經(jīng)濟(jì)性。

AAV產(chǎn)品中的衣殼成分、載體基因組、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物或混雜污染物都有激活宿主免疫反應(yīng)的可能，導(dǎo)致治療失敗或炎癥失控。即使AAV載體具有相對(duì)的免疫特權(quán)，但仍然能在視網(wǎng)膜下空間引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)。因此，AAV產(chǎn)品制造商必須改進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)，更好地純化產(chǎn)品并嚴(yán)格質(zhì)控。其產(chǎn)品具有低免疫原性。

理想的AAV生產(chǎn)系統(tǒng)需在確保足夠的病毒滴度的同時(shí)減少有害污染物，去除空殼或者錯(cuò)誤DNA包裝的載體，盡可能地減少臨床風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前還沒有從載體產(chǎn)品中去除錯(cuò)誤DNA包裝的技術(shù)；如何在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)從產(chǎn)品中去除空殼也是一大難題。

事實(shí)上，大規(guī)模生產(chǎn)AAV產(chǎn)品是保證臨床需求和降低產(chǎn)品價(jià)格的關(guān)鍵一環(huán)。從目前的應(yīng)用系統(tǒng)來(lái)看，相比于三重轉(zhuǎn)染HEK293系統(tǒng)或者哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)系統(tǒng)，Avirmax公司使用的桿狀病毒生產(chǎn)平臺(tái)具有顯著優(yōu)勢(shì)，是非常有吸引力的一種大規(guī)模臨床級(jí)載體生產(chǎn)策略。

該平臺(tái)利用昆蟲（草地夜蛾）細(xì)胞系 Sf9與兩種桿狀病毒表達(dá)載體共感染：一種桿狀病毒載體攜帶GOI及其在 ITR 區(qū)域之間的啟動(dòng)子，另一種桿狀病毒載體編碼rep和cap基因。這個(gè)系統(tǒng)可快速生產(chǎn)高質(zhì)量和高滴度的AAV產(chǎn)品，降低宿主細(xì)胞DNA錯(cuò)誤包裝，提供可靠的病原體安全保證，而且，在此基礎(chǔ)上可以較易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。

Avirmax的Sf9-AAV 大規(guī)模生產(chǎn)平臺(tái)。圖源：Avirmax官網(wǎng)

3、選擇合適疾病模型

之前的研究表明，使用小型模式動(dòng)物的AVV實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)到大型模式動(dòng)物之后，其轉(zhuǎn)染效率等結(jié)果出現(xiàn)了偏差。而且，一些模式動(dòng)物中觀察到的效果難以在人體試驗(yàn)中應(yīng)用和重現(xiàn)。由于新型AAV載體的這種不可預(yù)見性，有必要在開展AAV產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)之前使用大型模式動(dòng)物，比如非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型（如食蟹猴或恒河猴）進(jìn)行研究。據(jù)了解，Avirmax公司堅(jiān)持盡早使用大動(dòng)物體系，來(lái)驗(yàn)證新型AAV載體的臨床轉(zhuǎn)化成功率。

除了模型物種的選擇，研究者還需要考慮選用模型的年齡，治療方式，以及跟進(jìn)時(shí)間長(zhǎng)短等因素。通過(guò)選擇更合適的體外疾病模型，可靠地模擬人類生理水平，以得出更安全有效的臨床劑量范圍。

4、克服預(yù)存免疫力，擴(kuò)大患者適用人群

人類血清學(xué)研究顯示，由于之前接觸過(guò)野生型AAV，全球人群存在AAV中和抗體的流行率很高，大約67%的人有針對(duì)AAV1的抗體，72%有針對(duì)AAV2的抗體，40%有針對(duì)AAV血清型5至9的抗體。因此，AAV基因治療試驗(yàn)首先需對(duì)受試者進(jìn)行篩選，50%以上的患者可能會(huì)被排除試驗(yàn)。此外，載體預(yù)存免疫原性也是AAV產(chǎn)品再給藥的主要挑戰(zhàn)，這一問(wèn)題在體內(nèi)基因治療方面尤其突出。

為了讓更多的患者得到治療機(jī)會(huì)，開發(fā)能夠“逃避”中和抗體的AAV衣殼是解決辦法之一。最近，一種新興的方法引發(fā)了關(guān)注，為解決該問(wèn)題提供了新思路。該方法利用的是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的酶（imlifidase），目前正在測(cè)試的有IdeS和IdeZ。這類酶可在使用AAV產(chǎn)品之前使用，它們能在短期內(nèi)降解血液中預(yù)存的抗AAV中和抗體，為AAV載體到達(dá)目的細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)臨時(shí)的時(shí)間窗口。

用酶法降解預(yù)存AAV中和抗體，以增加轉(zhuǎn)導(dǎo)率。圖源：參考文獻(xiàn)9

臨床試驗(yàn)與審批的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

總之，基因治療獲得成功的關(guān)鍵是在可控炎癥的劑量下保證足夠的GOI表達(dá)水平，否則就會(huì)導(dǎo)致療效降低或喪失，需重新給藥或引起局部組織損傷，甚至威脅生命。

基因治療的潛力剛剛開始顯現(xiàn)。作為一種新的治療方式，AAV基因治療仍處于發(fā)展早期階段。相較于其他積累了大量經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)的生物制品（比如治療性抗體、重組蛋白），人們對(duì)AAV病毒載體的生物學(xué)特征的理解尚有待加深。

就目前的研發(fā)市場(chǎng)來(lái)看，專注于眼部疾病基因治療的公司越來(lái)越多。然而，我們看到很多研發(fā)項(xiàng)目都是集中在管線沖刺上，真正在解決基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題方面的研發(fā)力度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。即使有些產(chǎn)品沖進(jìn)臨床階段，也可能會(huì)遭遇各種安全效力的問(wèn)題，造成無(wú)法挽回的后果。

針對(duì)這一問(wèn)題，除了加強(qiáng)產(chǎn)品基礎(chǔ)研發(fā)的力度和深度，不斷完善與跟進(jìn)的臨床監(jiān)管也同樣重要，以明確和規(guī)范基因治療產(chǎn)品的臨床期望。

● 2008年4月，FDA首次發(fā)布人類基因治療指南。同年7月，F(xiàn)DA公布關(guān)于人類基因治療的更新指導(dǎo)文件草案，概述了當(dāng)前的監(jiān)管觀點(diǎn)；

● 2020年1月, FDA發(fā)布了視網(wǎng)膜疾病基因治療指南《Human Gene Therapy for Retinal Disorders》；

● 2021年9月30日，F(xiàn)DA發(fā)布了《行業(yè)指南草案：早期臨床研究中單一疾病多版本細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品的研究（Studying Multiple Versions of a Cellular or Gene Therapy Product in an Early-Phase Clinical Trial：Draft Guidance for Industry》(詳見參考文獻(xiàn)10)。在這項(xiàng)最新指南中，F(xiàn)DA創(chuàng)新地提出了對(duì)某一疾病的IND中，可用多個(gè)不同版本細(xì)胞和基因產(chǎn)品進(jìn)行臨床，并對(duì)有意實(shí)施這種臨床研究初步安全性和生物活性的評(píng)估提供了多項(xiàng)建議，包括如何組織和構(gòu)建 IND、提交新信息和報(bào)告不良事件（Adverse effect, AE）。該草案正在行業(yè)內(nèi)征求反饋意見，這一新指南草案一旦定案成文，為未來(lái)細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的早期開發(fā)速度和效率的提高有很大幫助。

盡管AAV基因治療仍存在很多挑戰(zhàn)和局限，但現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)表明AAV基因治療仍是一種安全、耐受性好和有效的方式。比如本文開頭提到的ADVM-022治療DME的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在高劑量毒性，但在低劑量試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)不良事件，而且ADVM-022的另一項(xiàng)治療濕性AMD的臨床試驗(yàn)顯示，低劑量與高劑量應(yīng)用患者中均未觀察到類似不良事件，這些患者的隨訪已達(dá)到治療后52周至2.5年。

在全世界范圍內(nèi)，rAAV占總基因治療產(chǎn)品的24%，在2015-2020年之間，F(xiàn)DA已收到99個(gè)rAAV基因治療的IND。隨著各項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步和臨床監(jiān)管的完善，我們期待更多的基因治療產(chǎn)品上市，惠及更多的常見眼部疾病患者，帶來(lái)長(zhǎng)久的治療益處。

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4. Beginner’s guide to the production of AAV vectors for gene therapy–Mentored by a CDMO.https://biovian.com/beginners-guide-to-the-production-of-aav-vectors-for-gene-therapy-mentored-by-a-cdmo/

5. Mark White. Addressing the Top Five Challenges to AAV-Based Gene Therapy with ddPCR.https://www.genengnews.com/insights/addressing-the-top-five-challenges-to-aav-based-gene-therapy-with-ddpcr/

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10. US Food and Drug Administration, HHS 【Docket FDA-2021-D-0776】 Studying Multiple Versions of a Cellular or Gene Therapy Product in an Early-Phase Clinical Trial：Draft Guidance for Industry, Availability.