寨卡病毒IgM抗體ELISA 96T/盒

樣本：(血清和血漿)

- 僅用于“體外”科研診斷（本司還有登革，瘧疾，錐蟲，恙蟲，黑熱病，西尼羅河，乙腦，基孔肯雅熱，鉤端螺旋體，立氏克體，等科研診斷試劑）

A.使用

酶免疫測定（ELISA），用于定量測定人血漿和血清中的寨卡病毒（ZIKA）的IgM抗體。僅用于“體外”診斷。

B.引言

寨卡病毒屬于黃病毒科和黃病毒屬，因此與登革熱，黃熱病，日本腦炎和西尼羅病毒有關。像其他黃病毒一樣，寨卡病毒是包膜和二十面體的，并且具有非分段的單鏈，正義RNA基因組。RNA基因組基因編碼非結構蛋白和結構蛋白，其zui具免疫原性的是NS1和ENV抗原。結構蛋白封裝病毒。有兩個寨卡病毒譜系：非洲譜系和亞洲譜系。系統發育研究表明，在美洲的病毒傳播與亞洲菌株密切相關，在2013年爆發期間在法屬波利尼西亞傳播。

寨卡病毒通過白天活躍的蚊子作為其載體傳播。它主要由雌性埃及伊蚊傳播以產卵，但是已經從伊蚊屬中的許多樹木類蚊子中分離出來，在蚊子中具有約10天的外部潛伏期。

自2015年以來，新聞報導提請注意Zika在拉丁美洲和加勒比地區的傳播。

2015年，在其胎兒有小頭癥的兩名孕婦的羊水中檢測到寨卡病毒RNA，表明病毒已經越過胎盤，可能造成母嬰gan染。

根據世衛組織2016年2月5日，寨卡病毒和小頭癥之間的因果關系“被強烈懷疑但尚未科學證明”和“盡管巴西的小頭癥病例與寨卡爆發有時空相關性，更強有力的調查和需要進行研究以更好地理解這種潛在的。

新的建議包括向沒有Zika發燒癥狀的孕婦提供血清學測試，這些癥狀在過去2-12周內從正在進行的寨卡病毒傳播的地區返回;對于沒有寨卡癥狀的孕婦，他們建議在孕期第五個月開始進行產前保健和隨訪測試。

C.測試原理

微板用與其它黃病毒顯示zui小交叉反應性的Zika病毒NS1合成抗原包被。

在*次孵育中，用稀釋的樣品處理固相，并且抗原捕獲抗ZIKV IgM（如果存在的話）。在洗掉樣品的所有其它組分后，在第二孵育中，通過加入用過氧化物酶（HRP）標記的抗hIgM抗體來檢測結合的抗ZIKV IgM。在固相上捕獲的作用于底物/色原混合物上的酶產生與樣品中存在的抗ZIKV IgM抗體的量成比例的光學信號。

在測定中進行IgG抗ZIKV的中和，直接在孔中進行，以在IgM的測定中阻斷由于這類抗體的干擾。

D.組件

每個試劑盒包含足夠的試劑進行96次測試。

微孔板：MICROPLATE

12條×8個用ZIKV特異性合成NS1抗原包被的微孔。將板密封到具有干燥劑的袋中。

2.負控制控制 -

1x2.0ml /瓶。準備使用控制。其含有1％山羊血清蛋白，10mM檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0 +/- 0.1,0.5％吐溫20,0.09％迭氮化鈉和0.1％Kathon GC作為防腐劑。陰性對照是黃色編碼的。

正控制ConTROL +

1x2.0ml /瓶。準備使用控制。其含有1％山羊血清蛋白，滅活的人抗ZIKV IgM，10mM檸檬酸鹽緩沖液pH6.0 +/- 0.1,0.5％吐溫20,0.09％迭氮化鈉和0.1％Kathon GC作為防腐劑。

陽性對照是深綠色編碼。

4.洗滌緩沖液濃縮液：WASHBUF 20X

1x60ml /瓶20x濃縮溶液。一旦稀釋，洗滌溶液含有10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.0 +/- 0.2,0.05％Tween 20和0.05％Kathon GC。

酶聯液：CONJ

1x16ml /瓶。準備使用和紅色編碼。其含有針對人IgM，5％BSA，10mM Tris緩沖液pH 6.8 +/- 0.1,0.1％Kathon GC和0.02％硫酸慶大霉素的辣根過氧化物酶綴合的多克隆抗體作為防腐劑。

6.色原/基質：SUBS TMB

1x16ml /瓶。其含有50mM檸檬酸鹽 - 磷酸鹽緩沖液pH 3.5-3.8,4％二甲基亞砜，0.03％四甲基聯苯胺（或TMB）和0.02％過氧化氫（或H 2 O 2）。

注意：要防止光存儲，對強烈的照明敏gan。

7.硫酸：H 2 SO 4 0.3M

1×15ml /瓶含有0.3M H 2 SO 4溶液。

注意：刺激性（H315，H319; P280，P302 + P352，P332 + P313，P305 + P351 + P338，P337 + P313，P362 + P363）。

8.標本稀釋液：DILSPE

2x60ml /瓶。其含有2％酪蛋白，10mM檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0 +/- 0.1,0.2％吐溫20,0.09％迭氮化鈉和0.1％Kathon GC作為防腐劑。用于稀釋樣品。

9.中和試劑：SOLN NEUT

1x8ml /瓶。其含有山羊抗hIgG，2％酪蛋白，10mM檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0 +/- 0.1,0.09％迭氮化鈉和0.1％Kathon GC作為防腐劑。

10.板密封箔n°2

11.包裝插入n°1

E.材料需要但不提供

1.校準微量移液器（1000,100和10ul）和一次性塑料吸頭。

2. EIA水（雙蒸餾水或去離子水，經處理以除去用作消毒劑的氧化性化學品的木炭）。

3.定時器有60分鐘或更高的范圍。

4.吸收紙巾。

5.校準的ELISA微孔板恒溫培養箱（干或濕）設置在+ 37℃（+/- 0.5℃公差）。

6.校準的ELISA微孔讀數器，具有450nm（讀數）和620-630nm（消隱）濾器。

7.校準的ELISA微孔板洗滌器。

8.渦流或類似的混合工具。

F.警告和注意事項

1.只有在負責實驗室的醫生的監督下，才能由經過專門培訓的技術人員使用該試劑盒。

2.參與實驗的所有人員必須佩戴防護實驗服，不含滑石的手套和眼鏡。應避免使用任何尖銳（針）或切割（刀片）設備。根據美國亞特蘭大疾病控制中心的建議，所有參與的人員應接受生物安全程序的培訓，并在國家衛生研究所的出版物“生物安全微生物和生物醫學實驗室” 1984年。

3.所有參與樣品處理的人員都應接種HBV和HAV疫苗，為疫苗提供安全和有效的疫苗。

4.在打開試劑盒和微量培養板以及進行試驗時，應控制實驗室環境，以避免污染物，如灰塵或空氣中的微生物制劑。保護色原/基板（或TMB）免受強光照射，避免進行測試的臺面振動。

5.收到后，將套件在2..8°C下存放在溫度控制的冰箱或冷藏室中。

6.不要在不同批次的試劑盒之間交換組件。建議同一批次的兩個套件之間的組件不應互換。

7.檢查試劑是否清澈，不含可見的重顆粒或聚集物。如果沒有，建議實驗室主管啟動套件更換的必要程序。

8.使用一次性吸頭避免血清/血漿樣品之間的交叉污染，并在每個樣品后更換。

9.通過使用一次性吸頭并在每次使用之間更換它們，避免試劑盒試劑之間的交叉污染。

10.不要在外部容器和內部（小瓶）標簽上規定的有效期后使用試劑盒。對已打開的試劑盒進行的研究沒有指出任何相關的活性損失，多達6次使用該裝置和長達6個月。

11.將所有標本視為潛在gan染性。所有人血清標本應按照美國亞特蘭大疾病控制中心的建議，按照健康研究所出版物“微生物和生物實驗室生物安全”（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories）中所述，在生物安全2級處理。 1984年。

12.在制備液體組分或將組分轉移到自動化工作站時，建議使用一次性塑料制品，以避免交叉污染。

13.在使用試劑盒期間產生的廢物必須按照關于化學和生物物質的實驗室廢物的國家指令和法律進行廢棄。特別地，從洗滌過程產生的液體廢物，來自對照/校準物的殘余物和來自樣品的液體廢物必須作為潛在gan染性物質處理并在廢物之前失活。建議的滅活方法是用10％zui終濃度的家用漂白劑處理16-18小時或者通過在121℃下高壓滅菌20分鐘進行熱滅活。

14.樣品和操作的意外泄漏必須用浸有家用漂白劑，然后用水浸濕的紙巾吸附。然后應將組織丟棄在指定用于實驗室/醫院廢物的適當容器中。

15.硫酸是刺激劑。如發生溢出，用大量水沖洗表面。

16.使用試劑盒產生的其他廢物（例如：用于樣品和對照品/校準品的提示，用過的微量培養板）應作為潛在的傳染性物質處理，并根據國家有關實驗室廢物的指令和法律處理。

G.樣品：準備和警告

1.通過靜脈穿刺無菌抽取血液，并使用用于臨床實驗室分析的樣品制備的標準技術制備血漿或血清。在用檸檬酸鹽，EDTA和肝素制備樣品中沒有觀察到影響。

2.樣品必須用代碼或名稱清楚標識，以避免誤解結果。強烈建議使用條形碼卷標和電子閱讀。

3.溶血（“紅色”）和明顯高脂血癥（“乳白色”）樣品必須丟棄，因為它們可能產生錯誤結果。含有纖維蛋白或重顆粒或微生物細絲和體的殘留物的樣品應被丟棄，因為它們可能導致錯誤的結果。

血清和血漿可以在收集后在+ 2°.8°C儲存長達五天。對于較長的儲存期，樣品可以在-20℃冷凍儲存幾個月。任何冷凍樣品不應多次冷凍/解凍，因為這可能產生可能影響測試結果的顆粒。

5.如果存在顆粒，則以2.000rpm離心20分鐘或使用0.2-0.8u過濾器過濾以清潔樣品用于測試。

H.組件和警告的準備

微孔板：

使微孔板在打開容器之前達到室溫（約1小時）。檢查干燥劑是否未變成深綠色，表明存儲有缺陷。

在這種情況下，致電Dia.Pro的客戶服務。

未使用的條必須放回鋁袋中，在干燥劑的存在下，牢固地壓縮并儲存在+ 2°.8°C。當*次打開時，殘留的條帶是穩定的，直到干燥劑袋內的濕度指示器從黃色變為綠色。

質控：

準備使用組件。使用前在渦流小心混合。不要稀釋！

洗滌緩沖液：

濃縮溶液的全部內容物必須用雙重蒸餾水稀釋20倍，并在使用前輕輕地顛倒混合。在制備過程中避免起泡，因為氣泡的存在會影響洗滌循環的效率。

注意：稀釋后，洗滌溶液在+ 2..8℃下穩定1周

酶聯液：

可以使用。使用前在渦流上充分混合。

小心不要用氧化性化學品，空氣驅動的灰塵或微生物污染液體。

如果該組分必須轉移，則僅使用塑料，可能是無菌的一次性容器。

色原/底物：

可以使用。使用前在渦流上充分混合。

小心不要用氧化性化學品，空氣驅動的灰塵或微生物污染液體。

不要暴露在強烈的照明，氧化劑和金屬表面。

如果該部件必須轉移，只使用塑料，可能無菌的一次性容器

樣品稀釋劑

準備使用組件。使用前在渦流小心混合。

中和試劑

準備使用組件。使用前在渦流小心混合。

硫酸：

可以使用。使用前在渦流上充分混合。

注意：刺激性（H315，H319; P280，P302 + P352，P332 + P313，P305 + P351 + P338，P337 + P313，P362 + P363）。

警告H語句：

H315 - 造成皮膚刺激。

H319 - 造成嚴重眼刺激。

防范語句：

P280 - 戴防護手套/穿防護服/戴防護眼罩/戴防護面具。

P302 + P352 - 如果皮膚接觸：用大量肥皂和水清洗。

P332 + P313 - 如果發生皮膚刺激：求醫/就診。

P305 + P351 + P338 - 如進入眼睛：用水小心沖洗幾分鐘。取出隱形眼鏡，如果有，容易做。繼續沖洗。

P337 + P313 - 如果眼睛刺激持續：求醫/就診。

P362 + P363 - 脫掉沾污的衣服，清洗后方可重新使用。

I.與工具箱組合使用的儀器和工具

1.微量移液器必須進行校準，以提供測定所需的正確體積，并且必須對那些可能偶然與樣品接觸的部分進行定期去污（家用酒精，漂白劑，醫院級消毒劑的10％溶液）。它們還應當定期維護，以便顯示1％的精度和+/- 2％的真實性。還應定期對工具箱部件的溢出物或殘留物進行去污。

2. ELISA孵化器必須設置在+ 37°C（允許+/- 0.5°C），并定期檢查以確保保持正確的溫度。干燥培養箱和水浴適用于孵育，條件是該儀器經過驗證用于ELISA測試的孵育。

3. ELISA洗滌器對測定的整體性能非常重要。在使用該套件進行常規實驗室測試之前，必須使用套件控制/校準器和參考面板對洗衣機進行仔細驗證和正確優化。通常4-5次洗滌循環（吸出+ 350ul /孔的洗滌溶液的分配= 1個循環）足以確保測定如預期那樣進行。建議在循環之間保持20-30秒的浸泡時間。為了正確設置它們的數量，建議使用試劑盒對照/校準器和良好表征的陰性和陽性參照樣品進行測定，并檢查以匹配以下“內部質量控制”部分中報告的值。必須根據制造商的說明對洗衣機的交付量和維護（針的凈化和清潔）進行定期校準。

4.孵育時間具有+ 5％的公差。

5.酶聯免疫吸附測定酶標儀必須配備450nm的讀取濾光片，并配備第二個濾光片（強烈建議使用620-630nm）進行消隱。其標準性能應為（a）帶寬<10 nm; （b）0至> 2.0的吸亮度范圍; （c）線性至> 2.0;重復性> 1％。在“測定程序”部分中鑒定的孔上進行消隱。必須定期校準讀取器的光學系統，以確保測量正確的光密度。應根據制造商的說明定期維護。

6.當使用ELISA自動工作站時，必須仔細設置，校準，控制和定期維護所有關鍵步驟（分配，孵育，洗滌，讀數，數據處理），以符合“內部質量控制“。測定方案必須安裝在設備的操作系統中，并且對于洗衣機和閱讀器進行驗證。此外，站的液體處理部分（分配和清洗）必須被驗證和正確設置。必須特別注意避免用于分配和用于洗滌的針所帶走。這必須研究和控制，以zui小化相鄰井的污染的可能性。當待測樣品數量超過20-30個單位時，推薦使用ELISA自動工作站。

7. Dia.Pro的客戶服務為用戶提供設置和檢查與套件結合使用的儀器的支持，以確保符合所述要求。還支持安裝與套件一起使用的新儀器。

L.前期分析控制和操作

1.檢查打印在外部標簽（主容器）上的套件的到期日期。如果過期，請勿使用。

2.檢查液體組分是否沒有被可見的顆粒或聚集物污染。

3.用無菌塑料移液管吸取少量體積，檢查色原/底物是無色還是淺藍色。

4.檢查運輸過程中是否有破損，箱體（主容器）內是否有溢出液體。檢查包含微孔板的鋁袋是否有刺孔或損壞。

5.如上所述稀釋20倍濃縮洗滌溶液的所有內容物。

6.讓所有其他組分達到室溫（約1小時），然后在渦旋所有液體試劑上輕輕混合。

7.將ELISA孵育器置于+ 37℃，并根據制造商的說明通過用稀釋的洗滌溶液預處理來制備ELISA洗滌劑。設置正確的洗滌循環次數，在儀器的驗證中發現，與試劑盒一起使用。

8.檢查ELISA讀數器是否打開，或確保在讀數前至少20分鐘打開。

9.如果使用自動工作站，請打開，檢查設置，并確保使用正確的測定方案。

10.檢查微量移液器是否設置為所需的體積。

11.檢查所有其他設備是否可用并準備就緒。

12.如果出現問題，請不要繼續進行測試，并通知主管。

M.測定程序

該測定必須根據以下報導進行，注意在測試中保持所有樣品的相同溫育時間。

1.將所需數量的條帶放入塑料支架中，仔細識別校準品和樣品的孔。

2.稀釋樣品1：101分配1ml樣品稀釋劑到一次性管中，然后10μl樣品; 使用前在渦流上混合。不要稀釋控制器，因為它們是即用型。

3.將A1留空以便進行消隱。

4.在除了A1孔之外的所有孔中分配50μl中和試劑，用于空白操作。

在識別的位置移液器100微升的陰性對照一式三份，100微升的陽性對照單一，然后100微升的稀釋樣品。

6.在+ 37℃下孵育微板60分鐘。

重要說明：條帶必須用粘合密封箔密封，只有當手動進行測試時。使用ELISA自動儀器時，請勿覆蓋條。

7.當*次孵育完成后，如前所述（第I.3節）洗滌微孔，

8.在所有的孔，除了A1，移液器100微升酶結合物。在+ 37°C孵育微孔板60分鐘。

重要提示：小心不要觸及孔的塑料內表面，使其*充滿酶偶聯物。可能發生污染。

9.當第二次孵育完成后，如前所述（第I.3節）洗滌微孔，

10.吸取100μl色原/底物到所有孔中，包括A1。

重要提示：不要暴露在強直射光下。因為可能生成高背景。

11.在室溫（18-24℃）下孵育保護的微孔板20分鐘。分配陽性樣品的孔和陽性校準品將從透明變為藍色。

12.使用與步驟10相同的移液序列，將100μl硫酸移至所有孔中以阻斷酶反應。添加終止溶液將使陽性校準物和陽性樣品從藍色變為黃色。

13.使用450nm濾光片（讀數）和620-630nm濾光片（背景扣除，強烈推薦），如在部分I.5中所述，測量每個孔中溶液的顏色強度，將儀器在A1或B1或兩者上。

一般重要說明：

1.如果第二個過濾器不可用，請確保在450nm讀數之前，在微孔底部不存在指紋。指紋可能在閱讀時產生假陽性結果。

2.在添加停止溶液之后必須進行讀數，并且添加后不超過20分鐘。可能發生色原體的一些自氧化，導致高背景。

3.原則上的任何陽性結果應通過替代血清學方法（例如：IFA）來確認。

4.當測試結果從實驗室傳送到信息中心時，必須注意避免錯誤的數據傳送。

5.必須由合格的醫生完成Zika病毒gan染的診斷并將其釋放給患者，并用另一種方??法（例如：Zika病毒RNA的PCR）確認事件。

N.測定方案

O.內部質量控制

在使用試劑盒的任何時間進行驗證檢查，以驗證測定的性能是否合格。

控制以下數據匹配：

如果測試結果符合上述要求，則進行下一節。

如果沒有，請不要繼續操作，并執行以下檢查：

P.結果

測試結果通過利用下式根據陰性對照（NC）的平均OD 450nm值確定的截止值來計算：

NC + 0.250 = Cut-Off (Co)

陰性質控 + 0.25 = 截止值 (Co)

為測試找到的值用于解釋結果，如下一段所述

重要的提示：

當結果的計算由ELISA自動化工作站的操作系統執行時，確保使用適當的公式來產生正確的結果解釋。

問：結果的解釋

測試結果被解釋為樣品OD 450nm值（S）和截止值（Co）或S / Co的比率，根據下表：

陰性結果表明患者尚未發展針對ZIKA的IgM抗體。

陽性結果指示正在進行的ZIKAgan染。

R.性能特性

已經在臨床外部中心和內部對選定的組進行了性能評價。

1.檢測限制

迄今為止，歐洲共同體沒有定義ZIKV IgM抗體檢測的國際標準。

在缺乏時，已經定義了源自具有慢性ZIKVgan染史的患者的內部黃金標準（或IGS），以便為裝置提供恒定的和優異的靈敏度。

2.靈敏度和特異性：

在外部臨床中心進行的研究中評價該性能，在gan染性疾病和ZIKV的診斷方面具有極好的經驗。

所有樣品ZIKV PCR +檢測陽性。

在來自正常個體和獻血者的超過400個陰性樣品的組上確定特異性。

還檢查了一組潛在干擾樣品（RF +，hemolised，lipemic等）。在檢查的樣品上沒有觀察到干擾。

用不同標準制備技術（檸檬酸鹽，EDTA和肝素）衍生的血漿和血清已被用于測定特異性。沒有觀察到由于樣品制備方法的假反應性。

冷凍樣品也已經過測試，以檢查樣品凍結是否干擾測試的性能。在清潔和無顆粒樣品上未觀察到干擾。

性能評估提供了以下值：

在來自其他黃病毒和基孔肯尼亞病毒的gan染的樣品組中觀察到一些交叉反應。

3.重現性：

它已經在不同運行中重復檢測的兩個樣品上計算。結果報告如下，總結在表中：

S.限制

假陽性已經在少于2％的正常人群中評估，主要是由于高滴度的RF。

含有纖維蛋白顆粒或聚集體的冷凍樣品可能產生假陽性結果。

觀察到與其他黃病毒和基孔肯尼亞病毒的交叉反應。

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